تولید رده سلولی ناک اوت IDUA توسط تکنیک ویرایش ژنی CRISPR/Cas

چکیده

مقدمه: موكوپلي ساكاريدوز تيپ (MPSI) I  بيماري شایع ذخيره اي ليزوزومي است كه به واسطه كمبود آنزيم آلفا-ال – ايدورونيداز  (IDUA) بر روی کروموزوم 4 (4p16.3) ايجاد مي گردد. اين آنزيم در تجزيه گليكوزآمينوگليكانها يا موكوپلي ساكاريدهاي درماتان سولفات و هپاران سولفات دخالت دارد و نقص در آنزیم مذکور منجر به افزایش سطح گلیکوز آمینو گلیکان ها (GAG) در خون و تجمع آن در اعضای مختلف بدن می شود. این ترکیبات پروتئوگلیکانی زیربنای ساختاری ماتریکس خارج سلولی و ساختار غضروفی نقاطی مثل مفاصل، دریچه­های قلبی را فراهم می­نماید؛ بعلاوه در تنظیم ارتباطات سلولی نقش دارد. در این مطالعه ما سیستم CRISPR/Cas را طراحی کردیم که ژن کد کننده انزیم IDUA را مورد هدف قرار داده  است و ما توانستیم سلوهای ناک اوت این ژن را تولید کنیم.

مواد و روش­ها: ابتدا sgRNA هدف IUDA در پلاسمید px335 کلون شد، با استفاده از نقشه برداری محدودکننده، پلاسمید نوترکیب تأیید شد. سپس پلاسمید نوترکیب به رده سلولی اپیتلیال انسانی، HEK-293 ترانسفکت شد. کلون های جهش یافته توسط آنالیز melting غربالگری شدند و جهش آنها با تعیین توالی سنگر مشخص شد.

يافته­ها: هضم آنزیمی و تعیین توالی سنگر، القای جهش ایندل را در دو کلون هتروزیگوت و یک کلون هموزیگوت تایید کرد.

بحث و نتيجه­گيري:  در این مطالعه، ما با استفاده از سیستم CRISPR-Cas9 یک مدل سلولی سندرم هورلر تولید کردیم که این مدل می تواند جهت استفاده در رویکرد های درمانی این بیماری استفاده شود.